豬卵泡顆粒細(xì)胞表型分析?。。?/h1>

來源：未知 發(fā)布日期：2021-03-29 08:55【大 中 小】

    探討干擾和過表達(dá)ＢＡＭＢＩ基 因?qū)ωi卵泡顆粒細(xì)胞的表型和功能的影響以及其對(duì) ＴＧＦ－β通路下游相關(guān)基因及凋亡基因的表達(dá)調(diào)控， 為解析豬卵泡發(fā)育和排卵數(shù)量調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。大腸桿菌ＤＨ５α感受態(tài)細(xì)胞、無毒素質(zhì)粒小提／ 大提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 ＤＮＡ 回收試劑盒、酵 母提取物、胰蛋白胨均購自天根生化科技（北京）有 限公司；限制性內(nèi)切酶 ＮｏｔⅠ、ＢａｍＨⅠ和 ＥｃｏＲⅠ、 Ｔ４ＤＮＡ 連接酶和 ＲＮＡ 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生 物工程（大連）有 限 公 司；總 ＲＮＡ 提取試劑盒購自 上海普洛麥格生物制品有限公司；氨芐青霉素購自 哈爾 濱 制 藥 六 廠；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ 和 ＤＭＥＭ／ Ｆ１２均購 自 英 杰 生 命 技 術(shù) 有 限 公 司；青 霉 素 購 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ細(xì)胞凋亡檢測(cè) 試劑盒購自 ＣＳＴ 公司。 超凈工作臺(tái)購自上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；超低溫 冰箱（－８０ ℃）和臺(tái)式 高 速 離 心 機(jī) 均 購 自 賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司；ＣｙｃｌｅｒＴＭ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ 儀、儀均購自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；ＤＮＰ－９０５２型電熱恒溫培養(yǎng) 箱和 ＤＫＢ－５－１Ａ 型超恒溫水浴鍋均購自上海精宏實(shí) 驗(yàn)設(shè)備有限公司；ＤＨＧ－９２４０ＡＳ型電熱恒溫鼓風(fēng)干 燥箱購自寧波東南儀器有限公司；ＭＯ－２２７０ＭＩ（Ｎ） 微波爐購自青島海爾制品有限公司。

    利用實(shí)時(shí)熒光定量 ＰＣＲ 方法 檢 測(cè) 卵 泡 顆 粒 細(xì) 胞過表達(dá)和 干 擾 ＢＡＭＢＩ后，ＴＧＦ－β信 號(hào) 通 路 中 下 游基 因（ＴＧＦ－βＲⅠ、ＴＧＦ－βＲⅡ、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、 ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）和 細(xì) 胞 凋 亡 基 因（Ｂａｘ、 Ｂｃｌ－２）ｍＲＮＡ 的 表 達(dá) 水 平，以 ＧＡＰＤＨ 為 內(nèi) 參 基 因。根據(jù) ＮＣＢＩ公布的豬基因編碼區(qū)，利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量 ＰＣＲ 引物，送生工 生物工程（上海）股份有限公司合成，ＰＣＲ 反 應(yīng) 體 系 ２５μＬ：ｃＤＮＡ 模 板 １μＬ， ＳＹＢ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ 染 料 １２．５ μＬ，上、下 游 引 物 （１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ９．５μＬ。實(shí)時(shí)熒光定 量 ＰＣＲ 反 應(yīng) 程 序：９５ ℃ 預(yù) 變 性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃ 變 性 １０ｓ，退火（具體溫度見表２）２０ｓ，７２℃延伸１０ｓ，共 ４５個(gè)循環(huán)；７２℃延伸４ｍｉｎ；４℃保存。試驗(yàn)對(duì)所有 樣本均進(jìn)行３個(gè)重復(fù)測(cè)定，并在每次試驗(yàn)時(shí)用同體 積的無菌水作為陰性對(duì)照。

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